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Biologia da Comunicação volume 6, Número do artigo: 18 (2023) Citar este artigo

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O exercício aeróbico é bem conhecido por promover a neuroplasticidade e a memória do hipocampo. No cérebro em desenvolvimento, o exercício precoce (ELE) pode levar a melhorias persistentes na função do hipocampo, mas os mecanismos moleculares subjacentes a esse fenômeno não foram totalmente explorados. Neste estudo, camundongos transgênicos abrigando o cassete "NuTRAP" (Nuclear tagging and Translating Ribosome Affinity Purification) em neurônios que expressam Emx1 (camundongos "Emx1-NuTRAP") sofrem ELE durante a adolescência. Em seguida, isolamos e sequenciamos simultaneamente a tradução de mRNA e cromatina nuclear de homogeneizados hipocampais únicos contendo neurônios que expressam Emx1. Essa abordagem nos permitiu acoplar translatomic com dados de sequenciamento epigenômico para avaliar a influência das modificações de histonas H4K8ac e H3K27me3 na tradução de mRNA após ELE. Um subconjunto de camundongos ELE passou por uma tarefa de aprendizado do hipocampo para determinar a expressão gênica e os fundamentos epigenéticos da contribuição do ELE para melhorar o desempenho da memória do hipocampo. A partir deste experimento, descobrimos a expressão gênica – relações de modificação de histonas que podem desempenhar um papel crítico na memória facilitada após ELE. Nossos dados revelam interações de modificação de gene-histona candidatas e implicam vias reguladoras de genes envolvidas no impacto de ELE na memória do hipocampo.

Experiências ambientais envolvem mecanismos epigenéticos para modular a expressão gênica e a função celular em neurônios pós-mitóticos1,2. As modificações das histonas e a metilação do DNA são particularmente importantes para a adaptação neuronal aos sinais ambientais, alterando a transcrição e a função sináptica3,4. Resultados comportamentais, como suscetibilidade ao estresse, busca de recompensa e memória de longo prazo, demonstraram envolver alterações na acessibilidade da cromatina e na expressão gênica nos neurônios5,6,7,8,9. Além disso, a paisagem da cromatina neuronal sofre ondas de modificações epigenéticas em função da própria maturação cerebral10,11,12. Períodos pós-natais de maior sensibilidade a estímulos ambientais podem levar a mudanças duradouras na função celular e podem resultar de mecanismos epigenéticos temporalmente específicos no cérebro em desenvolvimento13,14. Se os mecanismos reguladores de genes em neurônios pós-mitóticos são exclusivamente influenciados por experiências do início da vida para informar a função de longo prazo é uma questão que está apenas começando a ser explorada. Identificar os processos epigenéticos envolvidos na modulação da função dos neurônios, particularmente durante o desenvolvimento do cérebro, é fundamental para entender como as experiências do início da vida afetam os resultados comportamentais de longo prazo.

O exercício aeróbico melhora o desempenho em tarefas cognitivas envolvendo o hipocampo em humanos adultos e modelos animais15,16. O tipo, o momento e a duração da exposição ao exercício são importantes para determinar se há um impacto persistente na função do hipocampo17,18,19. Achados em roedores adolescentes e adultos implicam um papel para as enzimas modificadoras de histonas nos mecanismos de benefícios induzidos pelo exercício para a memória do hipocampo. Tanto o exercício voluntário quanto o tratamento com um inibidor de HDAC3 ativam a memória do hipocampo após um estímulo de aprendizado subliminar, aumentam a expressão do gene do fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) e promovem a acetilação de H4K8 nos promotores de éxons específicos do BDNF20,21,22. Isso sugere que o exercício envolve mecanismos reguladores epigenéticos para promover a plasticidade do hipocampo. Curiosamente, o exercício adulto também abre uma janela temporal para melhorias persistentes no desempenho da memória do hipocampo quando uma exposição reativa ao exercício é introduzida23, sugerindo uma "memória molecular" do exercício inicial23. Embora muitos desses estudos tenham sido realizados em adultos, estudos mais recentes demonstram que os efeitos do exercício na memória do hipocampo, alterações na expressão do fator neurotrófico, plasticidade sináptica e neurogênese são semelhantes nos períodos juvenil e adolescente17,24,25,26,27 . Descobertas anteriores de nosso laboratório demonstram que o exercício no início da vida (ELE) por uma semana (período juvenil; dias pós-natal (P) 21–27) ou três semanas (adolescência juvenil; P21–41) facilita a formação de memória de longo prazo do hipocampo em resposta a um estímulo de aprendizagem tipicamente insuficiente para formar a memória de longo prazo. Esse achado foi associado ao aumento da potenciação de longo prazo (LTP), bem como modulações da fisiologia sináptica no hipocampo CA117. Notavelmente, os efeitos da memória do hipocampo da ELE juvenil persistiram duas semanas após a cessação do exercício, o que é potencialmente mais longo do que o efeito do exercício na função do hipocampo adulto23. Juntando essas descobertas, é possível que o exercício (seja no início da vida ou na idade adulta) possa "estimular" a função do hipocampo para respostas facilitadas a experiências futuras (como futuras sessões de exercícios ou eventos de aprendizado do hipocampo). Os mecanismos epigenéticos são fortes candidatos para os efeitos primários do exercício, pois o epigenoma pode representar uma memória molecular da experiência do exercício, preparando a paisagem da cromatina para a expressão gênica eficiente, modulando assim a função neuronal e a produção comportamental22. Os mecanismos específicos subjacentes aos efeitos comportamentais e eletrofisiológicos sustentados de ELE não foram avaliados a partir da perspectiva de uma potencial memória molecular de ELE dentro do epigenoma.

8 for all samples, average yield RNA = 14.367 ng/ul; Supplementary Data 2)28. INTACT-isolated nuclei were further processed using the cleavage under targets and release using nuclease (CUT&RUN38) method to isolate antibody-specific protein-DNA interactions for downstream DNA sequencing. The resulting DNA libraries were of high quality and concentration when using specific antibodies (H4K8ac: average size = 1238 bp, average concentration = 126.8 nM; H3K27me3: average size = 1032 bp, average concentration = 146.5 nM; Supplementary Data 2). In contrast, the resulting DNA libraries using the non-specific IgG control had substantially lower concentrations (IgG: average size = 1035 bp, average concentration = 24.2 nM; Supplementary Data 2) further indicating that nuclear DNA from both isolations was of high starting quality./p> 8 for all samples; Simultaneous isolations: average RNA concentration = 14.367 ng/ul, RIN > 8 for all samples; Supplementary Data 2). The average RNA yield from the separate isolations (using a unilateral hippocampus) was approximately equal to half of the average yield of the simultaneous isolations (which combined bilateral hippocampi; Supplementary Data 2). Similarly, the final library concentrations for the separately isolated IgG CUT&RUN-seq libraries were also approximately half the concentration of the simultaneous isolations (average simultaneous: 24.2 nM, average separate: 11 nM; Supplementary Data 2). We interpret this to mean that nuclear DNA was fully intact in the simultaneous isolation because we did not obtain substantially more than double the concentration in the simultaneous vs separate isolations. Unilateral hippocampal homogenates yielded sufficient sequencing concentrations and quality to allow for library preparations from individual mice (Supplementary Data 2)./p>0.5 and p value < 2.2 × 10−16 (R = 1, p < 2.2 × 10−16; Fig. 2a). Next, CUT&RUN-seq was used to identify genomic regions interacting with two histone post-translational modifications (PTMs) of interest in the exercise and hippocampal memory fields: H4K8ac, a permissive histone mark associated with active transcription, or H3K27me3, a generally repressive histone PTM. We again applied Spearman's correlation to understand whether the simultaneous vs separate INTACT isolation methods could influence CUT&RUN-seq peak distribution. We compared normalized count data for CUT&RUN-seq peaks across a representative chromosome (chromosome 2). We binned 100 bp increments along the entire chromosome from the simultaneous and separate isolations using datasets generated from sedentary mice in our study. Normalized sequencing counts, which reflected reads assigned to binned genomic regions along chromosome 2, were highly similar between separate vs simultaneous conditions (H4K8ac: R = 0.65, p < 2.2 × 10−16; H3K27me3: R = 0.81, p < 2.2 × 10−16; Fig. 2b, c). Taken together, these experiments suggest that translating mRNA and nuclear DNA isolated from hippocampal homogenates using either simultaneous or separate isolation procedures are comparable in terms of quality, concentration, functional characterization, and normalized sequencing reads./p>0.5 and p value < 2.2 × 10−16; Fig. 3g–i). Overall, left and right hippocampal hemispheres did not demonstrate significant differences in normalized sequencing counts and peak distributions in the sedentary condition, suggesting that choice of hippocampal hemisphere is a less important factor to consider in obtaining representative data from the translatome and transcriptional regulation via histone modifications./p>30% expression increase with a p value < 0.05) our TRAP-seq revealed 297 upregulated and 338 downregulated hippocampal genes resulting from ELE (Fig. 4a and Supplementary Data 3). Many of the genes upregulated after ELE are known to be involved in exercise and/or hippocampal memory mechanisms, including Bdnf44 and Nr4a145. To functionally categorize ELE-induced DEGs, we performed a Panther Gene Ontology (GO) analysis46 focusing on the Molecular Function categorization and separated by upregulated and downregulated genes. Regardless of gene expression directionality, GO term categories with the most genes functionally assigned to them were "binding", "catalytic activity", "molecular function regulator", "transporter activity", "molecular transducer activity", and "structural molecule activity" (Fig. 4b). Many of the upregulated genes driving these categories are known to have critical roles in neuronal function (Kcna1, Slc24a4, Stxbp5l, Gabra2, and Camk2n2), neurodevelopment (Artn, Kdm7a, Sox21, Gap43, and Efna5), and hippocampal memory (Bdnf, Nr4a1 and Dusp5)./p>0.3785 and p-value < 0.05). b Panther Gene Ontology: Molecular Function top terms by most genes assigned. c Top 6 "Upstream Regulators" identified by Ingenuity Pathway Analysis (IPA). d Representative Gene Set Enrichment Analysis: Reactome leading-edge diagrams showing genes upregulated (d) or downregulated (d′) in ELE, and their categories of enrichment. *Abbreviated terms in d: (1) "transport of mature mRNAs derived from intronless transcripts", d′: (2) "activation of the mRNA upon binding of the cap binding complex and EIFs and subsequent binding to 43S", (3) srp-dependent cotranslational protein targeting to membrane, and (4) response of eif2ak4 gcn2 to amino acid deficiency./p>

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