O cenário de ubiquitinação da polimerase do vírus influenza A

Nature Communications volume 14, Número do artigo: 787 (2023) Citar este artigo

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Durante as infecções pelo vírus influenza A (IAV), as proteínas virais são direcionadas por ligases E3 celulares para modificação com ubiquitina. Aqui, deciframos e exploramos funcionalmente o cenário de ubiquitinação das proteínas da polimerase do IAV durante a infecção de células epiteliais alveolares humanas, aplicando análise de espectrometria de massa de peptídeos portadores de remanescentes de K-ε-GG (di-glicil) imuno-purificados. Identificamos 59 lisinas modificadas nas três subunidades, PB2, PB1 e PA da polimerase viral, das quais 17 afetam distintamente a transcrição do mRNA, a replicação do vRNA e a geração de vírus recombinantes por meio de mecanismos não proteolíticos. Além disso, análises funcionais adicionais e in silico indicam que a ubiquitinação em K578 no domínio PB1 thumb está mecanicamente ligada a transições estruturais dinâmicas da polimerase viral que são necessárias para a replicação do vRNA. As mutações K578A e K578R afetam diferencialmente a geração de vírus recombinantes, impedindo a síntese de cRNA e vRNA, a ligação de NP e a dimerização da polimerase. Coletivamente, nossos resultados demonstram que a neutralização de carga mediada por ubiquitina em PB1-K578 interrompe a interação com um loop não estruturado no terminal N de PB2 que é necessário para coordenar a dimerização da polimerase e facilitar a replicação do vRNA. Isso fornece evidências de que o IAV explora o sistema de ubiquitina celular para modular a atividade da polimerase viral para replicação viral.

Os vírus Influenza A (IAV) são patógenos respiratórios da família Orthomyxoviridae que representam uma ameaça substancial à saúde global por meio de epidemias sazonais e pandemias recorrentes. O genoma do IAV consiste em oito segmentos de RNA de fita simples de sentido negativo (vRNA). Cada vRNA é encapsidado por múltiplas cópias da nucleoproteína (NP) e uma cópia da RNA polimerase dependente de RNA viral trimérica (RdRP), composta pelas subunidades PB2, PB1 e PA1,2 para formar complexos de ribonucleoproteína viral (vRNPs)3. A transcrição de mRNAs virais e a replicação do genoma viral são mediadas por RdRPs e ocorrem no núcleo da célula. Embora os vRNPs de entrada sejam capazes de executar diretamente a síntese de mRNA após cap-snatching de pré-mRNAs derivados do hospedeiro4,5,6, a replicação do vRNA depende de proteínas virais recém-produzidas e complexos de polimerase. Ele prossegue de maneira independente do iniciador que envolve a geração de intermediários completos de RNA complementar de sentido positivo (cRNA), que servem como modelos para a síntese de vRNA7.

Investigações estruturais revelaram que o IAV RdRP é um complexo protéico flexível e altamente dinâmico que adota diferentes conformações durante a transcrição do mRNA e a replicação do vRNA5,8. O modelo atual de replicação do vRNA sugere que a transição da transcriptase para a replicase é promovida pela interação com uma segunda polimerase viral formando um dímero assimétrico9,10. Além disso, a formação do dímero assimétrico facilita a encapsidação da fita de cRNA nascente. Na segunda etapa da replicação do genoma, a iniciação da síntese de vRNA a partir de modelos de cRNA requer a formação de um dímero de polimerase simétrica por meio da interação com uma polimerase transativadora11,12. Para manter o equilíbrio ideal entre a transcrição do mRNA e a replicação do vRNA durante o ciclo de vida viral, a montagem cronológica dos dois dímeros é crítica e sugere-se que seja influenciada por fatores virais e celulares. Em particular, modificações pós-translacionais mediadas pelo hospedeiro (PTM) de proteínas virais foram propostas como interruptores moleculares dinâmicos para ajustar as ações do RdRP13,14. De fato, fosforilação15,16,17,18,19, ADP-ribosilação ou acetilação19,20,21, bem como ligação de ubiquitina (UB)22,23,24,25,26,27,28,29,30,31 e modificadores semelhantes à ubiquitina (UBL), como SUMO 1–332,33, NEDD834 ou ISG1535 para as subunidades da polimerase e NP foram relatados. Entre esses modificadores, a ubiquitinação é o mais abundante nas células humanas e regula a funcionalidade e a longevidade de uma ampla gama de proteínas e foi descrita para todas as subunidades do IAV RdRP com resultados pró e antivirais. A conjugação de PTMs como UB confere vários efeitos. Ele introduz uma superfície de ligação para outras proteínas de ligação de UBL, mas também pode proteger os locais de ligação da proteína na proteína modificada. Além disso, a UB transfere sinais biológicos, por exemplo, a degradação pelo proteassoma celular ou a translocação para um compartimento celular diferente. Uma consequência menos relatada da ligação UB é a neutralização da carga positiva na cadeia lateral do aceptor lisina pela formação da ligação dipeptídica, que pode resultar em alterações estruturais e afetar as interações com outras proteínas36. Até hoje, o impacto biológico das modificações específicas do local nas proteínas da polimerase do IAV para os processos de transcrição do mRNA viral e replicação do genoma permaneceu amplamente desconhecido.