Novo modelo de cortical

Scientific Reports volume 13, Número do artigo: 7809 (2023) Cite este artigo

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Os organoides corticais humanos (hCOs), derivados de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (iPSCs), fornecem uma plataforma para interrogar os mecanismos de desenvolvimento do cérebro humano e doenças em tecidos tridimensionais complexos. No entanto, os métodos atuais de desenvolvimento de hCO carecem de tecidos não neurais importantes, como a camada meníngea circundante, que demonstraram ser essenciais para a corticogênese normal e o desenvolvimento cerebral. Aqui, primeiro geramos hCOs a partir de uma única roseta para criar organoides mais homogêneos com tamanho consistente em torno de 250 µm no dia 5. Em seguida, aproveitamos um sistema de co-cultura 3D para encapsular organoides cerebrais com uma fina camada de células meníngeas do próprio estágios iniciais do desenvolvimento cortical. A análise de imunocoloração foi realizada para exibir diferentes marcadores da camada cortical durante diferentes estágios de desenvolvimento. O monitoramento em tempo real do desenvolvimento de organoides usando o IncuCyte exibiu morfologia aprimorada e aumento da taxa de crescimento ao longo do tempo. Descobrimos que organoides encapsulados em meninges ilustram melhor organização laminar exibindo maior expressão de REELIN pelos neurônios de Cajal-Retzius. A presença de células meníngeas resultou em maior expansão das células progenitoras intermediárias (IPCs) TBR2, da camada cortical profunda (CTIP2) e da camada cortical superior (BRN2). Finalmente, os organoides encapsulados na meninge aumentaram a formação glial radial externa e astrócitos ilustrada pela expressão mais forte dos marcadores HOPX e GFAP, respectivamente. Este estudo apresenta uma nova plataforma de co-cultura 3D para imitar mais de perto a estrutura cerebral cortical in vivo e nos permitir investigar melhor os mecanismos subjacentes aos distúrbios do neurodesenvolvimento durante o desenvolvimento embrionário.

O cérebro humano é composto por vários tipos de células, incluindo neurônios, astrócitos, micróglia e oligodendrócitos. Os atuais sistemas organoides cerebrais derivados de células-tronco pluripotentes fornecem importantes modelos in vitro para recapitular o córtex humano em desenvolvimento, permitindo-nos estudar o desenvolvimento do cérebro em condições saudáveis e doentes1,2,3,4,5. No entanto, existem várias limitações aos sistemas de modelo in vitro atuais que podem afetar sua reprodutibilidade e aplicabilidade. Uma dessas limitações é a variabilidade de lote para lote que pode surgir devido a diferenças nas populações de células iniciais, condições de cultura e propriedades de auto-organização das células6,7. Abordar essa limitação é crucial para o desenvolvimento de organoides como modelos confiáveis para estudar o cérebro humano. A introdução de uma abordagem baseada em roseta única nos permitiu gerar organoides mais consistentes e reprodutíveis, resultando em organoides mais homogêneos e definidos que imitam melhor os aspectos do desenvolvimento inicial do cérebro.

Outra limitação do modelo organoide é a falta de diversidade celular completa observada no cérebro humano8. Embora os organoides possam gerar alguns dos tipos de células encontrados no cérebro humano, nem todos os tipos de células são representados. Isso pode limitar a transdução de sinal adequada necessária para recapitular completamente os aspectos de desenvolvimento e arquitetura do cérebro humano com a complexidade apropriada. Para superar essa limitação, nossa abordagem é incorporar células meníngeas como um importante tipo de célula que desempenha um papel fundamental no desenvolvimento do cérebro. As meninges, um tipo de célula cerebral não neuronal, estão presentes desde os primeiros estágios embrionários do desenvolvimento cortical e parecem ser necessárias para a corticogênese normal e a formação da estrutura cerebral9,10,11,12. Estudos recentes identificaram um nicho não parenquimatoso da população de NSCs dentro das meninges que expressam marcadores precursores neurais que são capazes de gerar novos neurônios in vitro e in vivo13,14. Durante o desenvolvimento do cérebro, as meninges desempenham um papel crucial no desenvolvimento do hCO, liberando vários fatores morfogênicos necessários para a corticogênese. Estudos in vitro demonstraram que as células meníngeas podem secretar FGF-215, IGF216,17, CXCL1218,19,20,21 e ácido retinóico22,23,24 essenciais para a adequada corticogênese. Estudos in vivo também demonstraram que as meninges secretam uma variedade de moléculas de sinalização, incluindo Sonic hedgehog (Shh), que desempenha um papel fundamental no desenvolvimento do prosencéfalo ventral, e a família de proteínas morfogenéticas ósseas (BMP), que regula dorso-ventral padronização do tubo neural25. Outros fatores secretados pelas meninges incluem membros da família do fator de crescimento de fibroblastos (FGF), Wnt e Notch, que estão envolvidos na regulação da proliferação celular, diferenciação e sobrevivência em vários processos de desenvolvimento, incluindo neurogênese1,26,27,28, 29. Supõe-se que áreas enriquecidas com laminina nas meninges sejam essenciais para regular a liberação desses fatores. Portanto, a presença de meninges parece ser crucial para o desenvolvimento dos organoides cerebrais30.

5 × 105 cells in 1 ml volume. HMC were characterized by immunofluorescence; they are all positive for fibronectin and negative for GFAP and α-smooth muscle actin. 5 × 105 cells/ml, were purchased (1 ml/vial) in passage zero, expanded in meningeal cell medium MenCM consisting of 500 ml of basal medium, 10 ml of fetal bovine serum and 5 ml of meningeal cell growth supplement and 5 ml of penicillin/streptomycin (ScienCell catalog #1404) medium and were used up to passage number three./p> 250 µm by day 5 (Fig. 1c). Morphological observation showed well-defined lumen structures in the middle of the rosettes (Fig. 1c, g). Overall, single rosettes had > 1.8-fold increase in size from day 3 to 5 which was shown to be significant (p < 0005). (Fig. 1f). These data were confirmed with two additional iPSC lines (PCDH19 and CHD2). Data from these two lines are shown in (Supplementary Fig. S1). To characterize neural rosette emergence, we conducted a time course analysis on different neural stem/progenitor cell (NPC) markers. Only 2 days after dual SMAD induction, iPSC-derived rosettes started to show expression of neuroectodermal markers PAX6 and NESTIN NPCs and apical membrane marker PKC-Z (Fig. 1e1). At day five, well-defined polarized neuroepithelial-like structure was observed with distinguished expression of PAX6 and NESTIN NPCs in the ventricular zone (VZ) and strong expression of adherent junction markers of N-Cadherin and PKC-Z in the apical region which resembled neural tubes (Fig. 1e2, g)./p> 800µm by day 24 (Fig. 1i). Our approach to generate cortical organoids from single rosettes appears to rapidly produce homogeneous organoids and yield well-defined organized neuroepithelial rosettes./p> 1.5-fold-change) in hCOMs compared to control hCOs (Fig. 3c). Data were analyzed from four separate experiments and a total number of 18 organoids for the CC1 cell line and results replicated with the use of two additional cell lines (PCDH19 and CHD2) in Supplementary Fig. S6. Together, these results show that our novel co-culture system using human iPSCs and meningeal cells together can efficiently enhance the morphology and phenotype of cortical organoid formation and increase their growth in a specific time course./p>

10 cortical structures from 4 independent experiments). Error bars ± SD, all scale bars: 100 µm, (c,d) representative immunostaining images for preplate Cajal-Retzius marker REELIN after 10 weeks in hCOMs and hCOs and quantification of the relative thickness of the MZ area at week 10. For each cortical structure, three measurements were taken at 45° angles to obtain the mean. MZ thickness was statistically significantly expanded after 10 weeks in hCOMs compared to hCOs (p < 0.0005) (n = 4 biological replicates in total, n = 2 CC1, n = 1 PCDH19 and n = 1 CHD2, n = 10 number of organoids were analysed). Error bars ± SD, scale bars: 100 µm./p>

3.0.CO;2-D" data-track-action="article reference" href="https://doi.org/10.1002%2F1096-9861%2820010226%29431%3A1%3C88%3A%3AAID-CNE1057%3E3.0.CO%3B2-D" aria-label="Article reference 15" data-doi="10.1002/1096-9861(20010226)431:13.0.CO;2-D"Article CAS PubMed Google Scholar /p>

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