Astrócitos

Nature volume 616, páginas 764–773 (2023) Citar este artigo

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Astrócitos e neurônios interagem extensivamente no cérebro. A identificação de proteomas de astrócitos e neurônios é essencial para elucidar as redes de proteínas que determinam suas respectivas contribuições para a fisiologia e a doença. Aqui usamos a biotinilação1 dependente de proximidade específica de célula e específica de subcompartimento para estudar os proteomas de astrócitos e neurônios estriatais in vivo. Avaliamos os compartimentos citosólicos e da membrana plasmática de astrócitos e neurônios para descobrir como essas células diferem no nível de proteína em sua maquinaria de sinalização. Também avaliamos os compartimentos subcelulares dos astrócitos, incluindo pés terminais e processos finos, para revelar seus subproteomas e a base molecular da sinalização essencial dos astrócitos e funções homeostáticas. Notavelmente, o SAPAP3 (codificado por Dlgap3), que está associado ao transtorno obsessivo-compulsivo (TOC) e comportamentos repetitivos2,3,4,5,6,7,8, foi detectado em níveis elevados em astrócitos estriatais e foi enriquecido em astrócitos específicos subcompartimentos onde regulava a organização do citoesqueleto de actina. Além disso, experimentos de resgate genético combinados com análises comportamentais e avaliações moleculares em um modelo de camundongo de TOC4 sem SAPAP3 revelaram contribuições distintas de SAPAP3 astrocítico e neuronal para fenótipos semelhantes ao TOC repetitivo e relacionado à ansiedade. Nossos dados definem como astrócitos e neurônios diferem no nível de proteína e em suas principais vias de sinalização. Além disso, eles revelam como os subproteomas dos astrócitos variam entre os subcompartimentos fisiológicos e como os mecanismos de astrócitos e SAPAP3 neuronais contribuem para os fenótipos de TOC em camundongos. Nossos dados indicam que as estratégias terapêuticas que visam astrócitos e neurônios podem ser úteis para explorar no TOC e potencialmente em outros distúrbios cerebrais.

Os astrócitos são o tipo predominante de glia no sistema nervoso central e coevoluíram com os neurônios9. Os astrócitos são componentes vitais do cérebro10 e, assim como os neurônios, apresentam morfologias e propriedades que diferem entre as regiões cerebrais11,12,13,14. Tanto os astrócitos quanto os neurônios estão extensamente implicados em doenças cerebrais15, incluindo distúrbios psiquiátricos. No entanto, pouco se sabe sobre mecanismos moleculares astrocíticos e neuronais compartilhados ou separados e suas respectivas contribuições em regiões cerebrais relevantes para doenças psiquiátricas definidas ou fenótipos em camundongos.

Neurônios e astrócitos interagem anatômica e fisiologicamente, inclusive no estriado16,17. Nos cenários de fisiologia e doença, a maioria dos estudos comparou astrócitos e neurônios usando métodos neuropatológicos, fisiologia, marcadores celulares ou análises de expressão de RNA. Em relação ao RNA, embora inestimável, a relação entre os níveis de expressão do RNA e os níveis de proteína18 é altamente complexa; portanto, é crucial identificar mecanismos específicos baseados em proteínas para neurônios e astrócitos19. Além disso, para entender a biologia básica de astrócitos e neurônios, é necessário capturar identidades de proteínas e suas diferenças dentro de células morfologicamente intactas. Os procedimentos de dissociação celular e classificação celular ativada por fluorescência (FACS) cisalham a maioria dos processos astrócitos e neuronais e são particularmente prejudiciais aos astrócitos que normalmente respondem ao estresse tecidual20,21,22, viciando o uso desses métodos para proteômica. Como resultado, os proteomas de astrócitos e neurônios não foram diretamente medidos, comparados ou utilizados para entender suas contribuições para fenótipos relevantes na fisiologia ou doença psiquiátrica em qualquer espécie.

O estriado é o maior núcleo dos gânglios da base, um grupo de núcleos subcorticais envolvidos em movimento, ações e diversas condições neuropsiquiátricas23,24,25. O corpo estriado contém extensos contatos entre astrócitos e neurônios, 95% dos quais são neurônios espinhosos médios (MSNs) positivos para DARPP3216. À medida que os astrócitos perdem sua morfologia complexa após a dissociação (dados estendidos Fig. 1a-d), caracterizamos a composição de proteomas específicos do tipo de célula (astrócitos e neurônios) e compartimentos (membrana citosólica e plasmática (PM)) usando biotina ligase direcionada geneticamente (BioID2; Dados Estendidos Fig. 2a,b) entregues in vivo dentro do corpo estriado usando vírus adeno-associados (AAVs; Dados Estendidos Fig. 2b,c). Este método não usa dissociação celular ou FACS. BioID2 biotinila proteínas em resíduos de lisina livre na presença de biotina1,26. Depois de caracterizar BioID2 citosólico e construtos LCK-BioID2 direcionados a PM em células HEK-293 (dados estendidos Fig. 3), entregamos seletivamente BioID2 ou LCK-BioID2 a astrócitos ou neurônios usando um promotor GFAP truncado (GfaABC1D) ou promotor SYN1 humano27 e AAVs com tropismo preferencial de astrócitos (Astro) ou neurônio (Neuro), respectivamente (Fig. 1a e Dados Estendidos Fig. 2c–h). Astro BioID2, Astro LCK–BioID2 e as proteínas que eles biotinilaram foram detectados apenas em astrócitos espessos positivos para S100β, inclusive nas extremidades dos pés (Dados estendidos, Fig. 4a–d). Por outro lado, Neuro BioID2, Neuro LCK-BioID2 e suas proteínas biotiniladas foram detectadas em somata neuronal DARPP32-positivo e neurópilo, o que refletiu sua expressão axonal e dendrítica, respectivamente (Dados Estendidos Fig. 4e-h). As análises de Western blot confirmaram a biotinilação (Dados Estendidos Figs. 2e–h e 4; P < 0,01 em cada caso), o que permitiu a identificação de proteínas por cromatografia líquida–espectrometria de massa em tandem (LC–MS/MS).