Um sistema multifuncional para edição de genoma e grandes

Nature Communications volume 13, Número do artigo: 3430 (2022) Citar este artigo

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CRISPR SWAPnDROP estende os limites da edição do genoma para transferência de DNA in vivo em larga escala entre espécies bacterianas. Sua abordagem de plataforma modular facilita a adaptação específica da espécie para conferir a edição do genoma em várias espécies. Neste estudo, mostramos a implementação do conceito CRISPR SWAPnDROP para o organismo modelo Escherichia coli, o Vibrio natriegens de crescimento rápido e o patógeno vegetal Dickeya dadantii. Demonstramos a excisão, transferência e integração de grandes regiões cromossômicas entre E. coli, V. natriegens e D. dadantii sem extração de DNA intermediário limitante de tamanho. O CRISPR SWAPnDROP também fornece abordagens comuns de edição do genoma, incluindo inserções e exclusões sem cicatrizes, sem marcadores, iterativas e paralelas. O caráter modular facilita as aplicações da biblioteca de DNA e a reciclagem de peças padronizadas. Seu sistema de co-seleção sem cicatriz multicolorido melhora significativamente a eficiência da edição e fornece controles de qualidade visual durante todo o processo de montagem e edição.

Nos últimos anos, a relevância da edição do genoma em bactérias aumentou rapidamente em pesquisa básica, biotecnologia e biologia sintética. Novas tecnologias como CRISPR/Cas9 e síntese de DNA em larga escala colocaram a edição do genoma ao alcance de uma ampla comunidade científica. No entanto, modificações de grande porte, incompatibilidade de ferramentas individuais, bem como sistemas de alto rendimento ainda são desafiadores.

As etapas básicas da edição do genoma em bactérias são a introdução de DNA modelo exógeno na forma de plasmídeos, ssDNA ou dsDNA e a subsequente integração no cromossomo por meio de recombinação homóloga. A recombinação homóloga é um processo muito ineficiente, mesmo quando melhorado com sistemas de recombinação como λRED. Diferentes estratégias foram desenvolvidas para superar a triagem demorada para células editadas, por exemplo, a integração de marcadores de resistência a antibióticos ou marcadores metabólicos1,2,3,4. No entanto, o número de edições possíveis em uma célula é limitado pelo número de marcadores disponíveis, pois apenas uma edição por marcador é possível. Além disso, a introdução de genes marcadores adicionais no cromossomo pode causar interferência indesejada em unidades de transcrição adjacentes5,6. Para contornar o problema da limitação do marcador, as recombinases específicas do local, como a recombinase Cre- e FLP, são introduzidas para remover o marcador de seleção após a integração cromossômica7,8. Isso adiciona uma etapa adicional ao processo de edição e deixa sítios de recombinação ativos no genoma, o que acaba por limitar a aplicação dessa abordagem mesmo com o uso de sítios de recombinação alternativos9. Outra estratégia para evitar marcadores de seleção e outras cicatrizes é a substituição alélica oligomediada (OMAR). O DNA de cadeia simples (ss) curto é incorporado ao genoma por um evento de substituição alélica semelhante a Okazaki na forquilha de replicação e facilita mutações pontuais, pequenas deleções e inserções10. A automação e a ciclização desse método permitem modificações no genoma de vários genes11. No entanto, o OMAR é limitado pelo tamanho dos oligos ssDNA usados ​​e, portanto, edições maiores não são possíveis.

Para edição de genoma sem cicatriz maior, métodos de contra-seleção podem ser aplicados. Tais métodos contam com contra-seletores eficientes como as meganucleases I-SceI e I-CreI, que introduzem quebras de fita dupla em um sítio específico de 18 e 22 pb de comprimento12,13. A quebra da fita dupla leva à morte celular de células não editadas. Isso enriquece fortemente a população viável para células editadas com sucesso. No entanto, a abordagem requer uma etapa de edição clássica adicional, na qual o local alvo das meganucleases é primeiro integrado ao cromossomo no local de interesse.

A descoberta de CRISPR/Cas9 aboliu a integração inicial de um local de restrição específico. Semelhante a uma meganuclease, Cas9 é uma endonuclease. Em contraste com uma meganuclease, Cas9 não tem especificidade de sequência de DNA. A especificidade é mediada por um RNA guia (gRNA) complementar à sequência alvo. Possíveis locais-alvo são limitados apenas pela sequência do motivo adjacente do protoespaçador (PAM) (5'-NGG-3'), que deve estar localizado a montante da sequência-alvo. Devido à sua simplicidade, a contra-seleção Cas9 é amplamente utilizada. Os sistemas de plasmídeo que abrigam um Cas9 induzível e um sistema de recombinação foram projetados para selecionar deleções de genes, mutações pontuais e inserções curtas14,15. Esses sistemas dependem da transformação de oligonucleotídeos sintéticos ou DNA molde linear de fita dupla para recombinação homóloga e, portanto, não são adequados para inserção de tamanho grande. Para superar as limitações de tamanho, o REXER fornece o DNA modelo em um replicon epissomal16. Inserções de até 100 kb são extirpadas in vivo por CRISPR/Cas9 para facilitar a recombinação λRED. A seleção ocorre por meio de marcadores de seleção positivos e negativos, o que leva a cicatrizes no local de integração e requer uma integração prévia do primeiro conjunto de marcadores de seleção.