Visualizando a atividade do sistema nervoso entérico através do corante

Biologia da Comunicação volume 6, Número do artigo: 236 (2023) Citar este artigo

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Grandes avanços foram alcançados em tecnologias de imagem, mas a maioria das abordagens metodológicas atualmente usadas para estudar as funções neuronais entéricas dependem de corantes de contraste exógenos que podem interferir nas funções celulares ou na sobrevivência. No presente trabalho, investigamos se a tomografia de coerência óptica de campo total (FFOCT) poderia ser usada para visualizar e analisar as células do sistema nervoso entérico. O trabalho experimental em preparações completas de cólons de camundongos não fixados mostrou que o FFOCT permite a visualização da rede do plexo mioentérico, enquanto o FFOCT dinâmico permite visualizar e identificar células individuais in situ nos gânglios mioentéricos. As análises também mostraram que o sinal FFOCT dinâmico pode ser modificado por estímulos externos como a veratridina ou alterações na osmolaridade. Esses dados sugerem que o FFOCT dinâmico pode ser de grande interesse para detectar alterações nas funções dos neurônios entéricos e da glia em condições normais e patológicas.

O sistema nervoso entérico (ENS) é uma rede neuronal integrada presente no trato gastrointestinal (GI). Composto por neurônios e células gliais entéricas (EGC), o ENS regula as principais funções GI, abrangendo motilidade, secreção mucosa, proliferação celular, reparo tecidual, mas também funções imunológicas1. Defeitos na organização e funções do SNE contribuem para várias disfunções GI observadas em um amplo espectro de distúrbios digestivos e extradigestivos2.

Nos últimos anos, técnicas de imagem microscópica foram desenvolvidas para entender melhor as funções do ENS em condições normais e anormais. Por exemplo, foram feitos progressos combinando técnicas microscópicas de alta resolução com sondas fluorimétricas, como corantes sensíveis ao cálcio ou sensíveis à voltagem3. A compreensão da organização e vasculatura do ENS também foi fornecida por tecnologias como microscopia de folha de luz e tomografia de projeção óptica, que permitem a análise de seções de alguns centímetros quadrados de tecido digestivo excisado4,5. No entanto, essas abordagens técnicas podem ser realizadas apenas ex vivo, pois requerem limpeza do tecido e coloração imuno-histoquímica. A visualização in vivo do ENS humano foi obtida usando endomicroscopia confocal de sonda (pCLE), mas como a resolução e a profundidade de penetração eram muito baixas, a dissecção endoscópica da submucosa6 ou coloração com violeta de cresilo6 foi necessária para obter uma imagem clara do ENS7. Neste contexto, novas tecnologias que fornecem alta resolução espacial e imagens dinâmicas sem corantes do ENS são de grande interesse.

Nesse sentido, a tomografia de coerência óptica (OCT) pode ser muito útil, pois permite a visualização das estruturas internas dos tecidos por meio da análise interferométrica da luz retroespalhada e refletida8. Essa tecnologia não invasiva e de alta velocidade depende do contraste inerente do tecido para criar a reconstrução volumétrica do tecido. Essa estratégia de imagem é mais amplamente usada para diagnosticar doenças no olho humano9, mas quando combinada com uma sonda de fibra óptica, a OCT pode adquirir imagens do sistema cardiovascular, respiratório ou digestivo10. No intestino, a OCT endoscópica tem sido tipicamente usada para o diagnóstico de esôfago de Barrett11 e dados preliminares foram obtidos para outras indicações, como doenças inflamatórias intestinais e câncer colorretal12,13. A OCT endomicroscópica in vivo com uma resolução típica de dezenas de mícrons14 tem uma resolução muito baixa para visualizar o ENS, mas uma resolução mais alta pode ser obtida com duas implementações dessa técnica: FFOCT15,16 e SD-OCT17,18,19 de alta resolução. Neste artigo apresentamos resultados obtidos com o FFOCT, que adquire imagens 2D en face usando objetivas de alta abertura numérica e luz visível. Permite a geração de imagens com resolução micrométrica e subcelular e também podem ser coletados dados volumétricos alterando a profundidade de aquisição da imagem OCT en face. Sua aplicação tem sido explorada principalmente para a detecção de margem tumoral intra-procedimento em vários órgãos20, incluindo o cérebro21. Também foi relatado para imagens das estruturas oculares22,23. Apesar de alguns esforços iniciais24, o desenvolvimento de uma versão endoscópica do FFOCT ainda não foi alcançado. Nas amostras ex vivo do intestino, a FFOCT demonstrou sua capacidade de gerar imagens do plexo mioentérico no trato GI de camundongos e humanos25. No entanto, esse método de imagem não visualiza os neurônios e as células gliais nos gânglios entéricos, em parte devido aos fortes sinais de retroespalhamento produzidos pelos tecidos circundantes, como células musculares ou pelo SNE, e pela presença de ruído speckle. Uma nova ferramenta chamada FFOCT dinâmica (D-FFOCT) melhorou muito o contraste celular em tecidos complexos, analisando as flutuações temporais da luz retroespalhada de tecidos e células26. Para a análise temporal do micromovimento dos constituintes celulares, que está nas bases do contraste intrínseco do D-FFOCT, os sinais OCT são coletados ao longo do tempo do mesmo plano de imagem, o que, por sua vez, também reduz o ruído adicional e melhora a qualidade da imagem. O contraste dinâmico também foi implementado na tecnologia SD-OCT de alta resolução, que fornece imagens transversais do tecido, em comparação com o plano de imagem en face do D-FFOCT27. Micro-OCT com contraste dinâmico foi usado para visualização da microanatomia das vias aéreas28, colo do útero e esôfago29. Esforços recentes estão focados em melhorar ainda mais a velocidade de aquisição e qualidade de imagem de D-FFOCT e micro-OCT com contraste dinâmico para permitir imagens in vivo30,31,32. Ao mesmo tempo, a tecnologia micro-OCT foi traduzida com sucesso para um design endoscópico33,34. O projeto preliminar do endoscópio micro-OCT com o contraste dinâmico foi apresentado35, mas o desafio da estabilização do tecido durante a longa aquisição de dados necessária para extrair o contraste dinâmico permanece como uma grande limitação. Os mecanismos celulares subjacentes às flutuações temporais dos sinais OCT também permanecem desconhecidos, mas alterações na atividade metabólica celular podem ser parcialmente responsáveis, pois a inibição da atividade mitocondrial usando rotenona ou da glicólise usando 2-desoxi-D-glicose reduziu significativamente a intensidade do sinal OCT26. Curiosamente, células epiteliais ou imunes individuais que não puderam ser identificadas individualmente por FFOCT, podem ser visualizadas por D-FFOCT36. Isso é encorajador, mas até o momento, nada se sabe sobre a capacidade do D-FFOCT de gerar imagens do ENS ou dos mecanismos biológicos subjacentes aos sinais D-FFOCT das células ENS.